数字微流控+比色法环介导等温扩增实现多种疾病的现场可视化诊断

  通常情况下，样品一定要通过冷链运输到配备良好的医院或检验测试中心进行仔细的检测。传统的检验测试过程高度依赖专业方面技术人员进行人工操作，从样品到结果的整一个完整的过程耗时较长，不足以满足快速现场检测的需求，特别是在资源有限的地区。此外，样品的运输不仅增加了成本，在储存和运输条件不当的情况下还可能会引起样本失效，造成假阴性结果。因此，开发快速、简单、低成本的现场检验测试平台具备极其重大意义。

  近日，北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院（UIC）雷波教授团队、暨南大学董铖副教授与珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司合作开发了一种基于数字微流控（DMF）技术和环介导等温扩增（LAMP）显色反应的可视化检测平台。

  该平台包含多个反应单元，可同时检测多个样本中的多个靶标基因，大幅度的提升了检测效率。此外，利用DMF强大的液滴操控能力，实现了自动化终点检测，避免了传统终点检测的新方法中由于开盖等人工操作引起的污染问题。该研究通过将高浓度的干燥染料应用于LAMP的显色检测，大幅度的提升了小体积反应液滴（5 μl）的显色程度，使得反应结果无需特定的光源条件，在环境光照下即可进行肉眼判读。

  图1 用DMF-LAMP办法来进行对虾疾病诊断：（a）样品制备；（b）芯片上操作和LAMP反应；（c）DMF芯片的侧视图和控制管理系统的方块图；（d）中性红的分子结构和由阳性LAMP扩增引起的颜色转变；（e）从样品到结果的整一个完整的过程的时间轴

  该平台能应用于水产病害检测，快速、准确地检测出对虾的三种常见病原体：肠细胞隐孢子虫（EHP）、传染性皮下和造血组织坏死病毒（IHHNV）以及白斑综合征病毒（WSSV），检测限为101拷贝/μL DNA。在这项研究中，该团队还对DMF-LAMP办法来进行了特异性和真实样品检验测试能力的评估。特异性实验根据结果得出，该方法在与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌以及早期死亡综合征（EMS）和对虾血细胞虹彩病毒（SHIV）等水及水产品中常见病原体的交叉反应测试中均无非特异性扩增，表现出良好的特异性。在真实样本检测实验中，分别用DMF-LAMP法和qPCR商业试剂盒对58个虾样本做检测，结果表明，DMF-LAMP方法与商业化的qPCR方法检验测试结果高度一致，Kappa值在0.91至1之间，证明了该方法在实际应用中的可靠性和准确性。

  图2 DMF 芯片设计与制造：ITO玻璃上涂有疏水表面作为顶板，覆有疏水涂层的PCB基板被用作底板。在芯片组装之前，底板上装载了LAMP试剂并进行了风干处理。这两个板之间夹着一个0.6 mm的间隔层用于液滴传输和LAMP反应 该团队还提出一种基于RGB的图像处理方法，利用智能手机在不同室外光照下获得结果图像，并且通过RGB分析，提出了一种简单的判读方法，未来有望创建自定义的手机App，以实现大批量结果的快速自动化分析。

  图3 基于RGB的图像处理分析：（a）在DMF芯片上进行包含中性红的LAMP反应，并使用智能手机捕捉图像。手动选择感兴趣区域（ROI），并在ImageJ中测量ROI的平均RGB值；（b）根据在实验室LED照明下捕捉的图像提取RGB值，比较阴性反应（n = 120）和阳性反应（n = 120）的平均值；（c）由阴性和阳性反应RGB值计算得出的差值；（d）在不同照明条件下，绘制阴性（N-）和阳性（P-）结果的R/G比和B/G比的图表

  总体而言，该研究建立的DMF-LAMP平台在临床、生物医学、食品安全和环境等领域具有广泛应用前景，具有成本低、简单易操作，检测效率高等优势。未来将进一步在该平台上整合样本处理如核酸提取等步骤，以实现“样本进-结果出”的一体化检测。

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