罕见遗传病中的异常相分离和核仁功能障碍

  蛋白质编码基因中的数千个遗传变异与疾病有关。然而，大多数变体的功能影响是未知的，因为它们发生在功能定义欠佳的

  2023年2月8日，来自德国马克斯普朗克分子遗传学研究所的Denes Hnisz团队、Malte Spielmann团队与柏林夏里特医学院的Denise Horn团队合作在Nature杂志上在线发表了题为Aberrant phase separation and nucleolar dysfunction in rare genetic diseases的文章，揭示了无序区域中与疾病相关的变异体会改变相分离，导致错误分配到核仁并破坏核仁功能。研究人员通过对短指、多指和胫骨再生障碍综合征病人及家系进行测序分析，在HMGB1中发现了自发性移码变异体（de novo frameshift variants），移码后富含精氨酸的碱性尾取代了HMGB1原有的无序酸性尾，进而改变了HMGB1相分离，增强其向核仁的分配并导致核仁功能障碍。更有意思的是，作者在无序羧基末端尾部中建立了一个超200,000变体的目录，并鉴定了600多个移码变体，这些变体在转录因子和其他蛋白质中产生富含精氨酸的碱性尾巴。通过对其中13个疾病相关变异体来测试，其中12个变体增强了其核仁分配，并改变rRNA的生物发生。该研究确定了罕见复杂综合征的原因，并表明大量遗传变异可能使核仁和其他生物分子凝聚物失调。

  BPTAS（brachyphalangy, polydactyly and tibial aplasia/hypoplasia syndrome，短指骨、多指和胫骨再生障碍/发育不全综合征）是一种极其罕见的复杂畸形综合征，分子病因尚不明确。在该研究中，五人（I1-I5）被诊断出患有BPTAS。患者均表现出独特的骨骼表型，包括短而畸形的下肢，其特征是胫骨再生障碍或发育不全、轴前多指和大关节挛缩（图1a-b）；与下肢相比，上肢的异常没那么严重，包括短指或手指长度不规则的短指（1a-b）。BPTAS患者（该研究中以及之前报道的患者）也表现出不同的颅面、神经和泌尿生殖系统特征。

  作者对I1进行了基因组测序，并检测到一种潜在的致病变异：HMGB1杂合移码NM_002128.7：c.556_559delGAAG；p.（Glu186Argfs*42）（图1c-e）。HMGB1编码高度保守的、低特异性的DNA结合因子，与细胞信号传导【6】、细胞运动【7-8】、碱基切除修复【9】和染色质环相关【10】。I1及其父母的Sanger测序证实了该移码变体的存在，并且是自发性突变。I2和I3中HMGB1的Sanger测序以及I4的三外显子组测序确定了类似的de novo frameshift：NM_002128.7：c.551_554delAGAA；p.（Lys184Argfs*44）（图1c-e），在I5中也检测到这种变异。两个移码突变导致几乎相同的带正电荷的序列（图1d-f）。

  为了研究HMGB1中移码突变的潜在致病作用，作者首先探索了野生型（WT）和突变蛋白的结构和序列特征。HMGB1包含两个负责DNA结合的HMG box和一个C端酸性尾巴。据预测，酸性尾巴是无序的，并且位于大约60个氨基酸的长保守IDR内。许多蛋白质的 IDR，包括转录因子、共激活因子和RNA聚合酶II（RNAPII），通过介导多价低亲和力相互作用有助于相分离。那么引起BPTAS的移码突变是否会改变HMGB1的相分离能力？作者纯化了eGFP标记的HMGB1，并检测了它们的体外行为。WT全长HMGB1在10% PEG下形成液滴，液滴的数量和大小随着蛋白质浓度的增加而增加。相比之下，移码突变体HMGB1形成无定形凝聚物，其饱和浓度较低，并且在光漂白后，恢复荧光的速度比WT HMGB1液滴慢，表明HMGB1中的移码增强了体外冷凝物的形成并改变了冷凝物的性质。哺乳动物细胞核含有许多生物分子缩合物，例如核仁、异染色质、共激活剂和RNAPII缩合物，作者通过体外模型观察HMGB1在细胞核内不同大分子缩合物中的分配情况，发现突变体HMGB1在核仁中的分配显著增强。

  随后，作者探究了突变HMGB1在细胞中的凝聚行为。通过在U2OS细胞中表达eGFP标记的HMGB1，WT HMGB1表现出弥漫性核定位；相反，突变体HMGB1定位于离散的核包涵体中。突变体HMGB1 IDR的异位表达也可导致U2OS细胞中核包涵体的形成，表明突变体HMGB1的替换IDR是其亚核定位改变的原因。突变的HMGB1核内含物通常含有空腔并且类似于核仁。核仁是相分离的多相缩合物，含有富含NPM1的外部颗粒成分和富含FIB1的内部致密原纤维组分。为了了解突变HMGB1核内含物的性质，作者在U2OS细胞中表达了RFP-FIB1和eGFP-HMGB1。突变HMGB1内含物中的空腔倾向于囊括FIB1。光漂白（FRAP）实验显示HMGB1壳在FIB1核心周围显示出停滞的动力学。这些根据结果得出，突变的HMGB1内含物可能是异常的、停滞的核仁。通过进一步靶向诱变实验揭示，移码突变体HMGB1的核仁错误分配取决于移码产生的序列中的精氨酸残基。核糖体RNA（rRNA）产生、核糖体功能及细胞活力检测结果为，细胞中HMGB1移码突变体的存在会破坏核仁功能并具有细胞毒性。

  根据5例BPTAS患者的临床和遗传信息以及功能数据可将HMGB1移码变异归类为致病性变异。该分类是根据美国医学遗传学和基因组学学院的标准（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）进行的【11】。在BPTAS个体中观察到的两种移码都导致蛋白质高度保守的酸性尾巴的替换（ACMG标准PM1），并通过MutationTaster（ACMG标准PP3）将其归类为致病性。有必要注意一下的是，在 gnomAD 数据库 （v.2.1.1）中列出的 HMGB1 尾部的 43 个非同义变异中，只有 4 个变异引入天冬氨酸和谷氨酸以外的氨基酸（ACMG 标准 PM2）。所有先前描述的致病性HMGB1变异都与没有严重骨骼异常的神经发育表型相关，因此与BPTAS不同。

  最后，为了探究在其他疾病中是否有几率发生用富含精氨酸的碱性尾替换无序的C端尾，并造成的核仁错误分配和功能障碍，作者在细胞蛋白内在无序的尾巴中生成了遗传变异目录。首先，作者注释了5,618个基因的9,303个亚型，这些基因的C端IDR由至少20个氨基酸组成。然后，确定了注释的5,618个基因的无序尾巴中发生的遗传变异。这些分析揭示了C端IDR中的249,464个遗传变异，包括10,023个截断变异和3,888个移码，用≥20个氨基酸替换C端序列。在3,888个移码变异中，426个在ClinVar中被注释为致病性，763个是1000基因组计划中的常见变体，189个在dbSNP数据库中。移码与高于中等水准的致病性相关，并且富集了致病变异的移码。编码转录因子的基因在那些含有C端IDR突变的基因中高度富集。在3,888个移码变体中，预计624个会产生由至少15%精氨酸残基组成的序列，其中101个在 ClinVar 中被归类为致病性。作者从目录中选择了9种转录因子（HMGB3, FOXC1, FOXF1, MYOD1, RAX, RUNX1, SOX2, PHOX2B和FOXL2）和4种其他蛋白（MEN1, SQSTM1, CALR和DVL1）进行功能测试，证实在C端IDR中产生富含精氨酸碱性尾巴的疾病相关移码会导致核仁错误分配和功能障碍。

  综上所述，该研究表明无序区域中与疾病相关的常见变异可能会改变蛋白质的相分离和生物分子凝聚物的分配。该研究数据确定，HMGB1中用富含精氨酸的碱性尾巴替换无序尾巴是BPTAS的病理机制。富含精氨酸的移码发生在数百种蛋白质中，这在某种程度上预示着数百种具有先前未知功能的疾病相关和常见遗传变异存在共同机制。异常相分离和核仁功能障碍有几率发生在广泛的遗传条件下，作为共同的潜在分子病理机制。此外，该研究中的IDR变体目录为探索疾病相关变体如何改变生物分子凝聚物的进一步模型提供了资源。作者觉得相分离的破坏可能经常发生在遗传疾病中，对潜在分子基础的进一步研究有几率会使以治疗为目的改变相分离的未来策略。

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