LONG TAQ DNA聚合酶的特点

  LONG TAQ DNA聚合酶是由pfu DNA Polymerase和Taq DNA聚合酶按照一定的比例混合而成。两种酶协同作用实现了扩增效率、合成速度和延伸性能的完美统一，在长片段PCR反应中具有独特的优势，可以合成超长的DNA片段。另外，此酶具有比Taq DNA聚合酶约5倍的PCR可信度。该酶的大多数PCR产物3端带碱基A，能够最终靠TA克隆法进行克隆。Long Taq DNA聚合酶是专门用于扩增长片段的嗜热DNA聚合酶，Long Taq DNA聚合酶的保真性是Taq DNA聚合酶的3倍，简单模板的扩增长度可达40kb。

  在扩增复杂模板（如GC-rich或重复序列）时，LongTaq DNA聚合酶的扩增效率明显高于Taq DNA聚合酶，很适合复杂模板的PCR扩增。扩增产物具有两种末端：平末端与3，-dA突出末端。配以专为长片段PCR优化的反应缓冲液，很适合对长片段的扩增。LF-Taq扩增性能优异,能在极短的时间内完成高效的PCR扩增.用普通Taq DNA聚合酶的进行PCR反应延伸时间一般为1kb/min,快速DNA聚合酶为1kb/10-15 sec,进行8kb产物的PCR反应可在1小时内完成.LF-Taq对简单模板的扩增可达40kb,对复杂模板的扩增也可达20kb。

  2．反应速度快，聚合速度高达10-15sec/kb，可为科研人员节约多达70%的实验时间。

  3．扩增效率高，同等条件下产量远高于普通Taq酶，在扩增片段时优势尤其明显。

  采用常规苯酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测提取产物并置于-20℃保存。参照Splawski和Syrris等的相关研究设计KCNQ1基因的17对引物、KCNE1基因的3对引物和KCNH2基因的19对引物,交由上海英潍捷基生物公司合成。采用聚合酶链反应(PCR)扩增三个基因的全部外显子。PCR反应体系如下：采用Platinum Long Taq反应体系共25uL,除了1uL模板DNA,其余24uL的Supermix组成为：10xPCR缓冲液2.5uL2.5mM dNTP混合液2uL,50mM MgCl2O.75uL,5uM上游及下游引物各1uL,Platinum Long Taq DNA聚合酶0.2uL,其余加入灭菌蒸馏水补足体积。上述反应体系的扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s及72℃延伸90s,经过35个循环后,再以72℃5min延伸,终末以4℃保存。PCR完成后采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定,对于电泳结果不满意的,重新优化反应体系和反应条件,直至最佳效果。

  最后由上海英潍捷基生物公司采用3730XL型DNA测序仪对扩增产物直接测序。测序结果应用Chromas软件进行BLAST同源比较,如有碱基改变,则在NCBI的SNP数据库中查找,确定是不是为已公布的变异位点,明确是不是真的存在氨基酸序列改变。扩增家系成员该变异位点的相应外显子并进行基因检测分析。同时筛查100名正常对照成员。

  [8]李岩.先天性长QT综合征的基因突变检测及常见基因型与表现型的相关性研究[D].南方医科大学,2012.

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