干货！常用PCR技能及原理

　　依据相对份额和反响器的体积，就能够推算出原始溶液的核酸浓度。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于比如低频等位基因的区分、病毒滴定和二代测序文库的肯定定量。

　　PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反响，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，系统中参加dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等进程，体外仿制出与母链模板DNA互补的子链DNA的进程，能快速特异地在体外扩增任何意图DNA。

　　惯例PCR的扩增开端时刻并不是放进PCR仪，工作程序才开端扩增。当系统装备完结的时分，扩增就开端了，这可能会引起非特异性扩增呈现，热发动PCR能处理这一问题。什么是热发动PCR？当反响系统制造好后，在反响初始加热阶段或“热发动”阶段，酶修饰物在高温下（一般高于90 ℃）被开释，使得DNA聚合酶被激活。详细激活时刻和温度取决于DNA聚合酶以及热发动修饰物的性质。该办法首要运用抗体、亲合配体、或化学修饰物等修饰物，来按捺的DNA聚合酶的活性。因为DNA聚合酶在常温下的活性被按捺，热发动技能为在常温下制造多个PCR反响系统供给了极大的便当，且无需献身PCR反响的特异性。

　　反转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)，是从mRNA反转录成cDNA并以此为模板进行扩增的一种试验技能。试验流程是先提取安排或细胞中的总RNA，以Oligo（dT）为引物，运用反转录酶组成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而取得意图基因或检测基因表达。

　　注：oligo(dT)是由数量少于20的脱氧胸苷酸衔接而成的核苷酸链，它能够特异性地结合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾)，然后使反转录酶只能反转录含有poly(A)尾的mRNA。

　　荧光定量PCR（Real-time QuantitativePCR，RT-qPCR）是指在PCR反响系统中参加荧光基团，运用荧光信号堆集实时监测整个PCR进程，最终通过规范曲线对模板进行定量分析的办法。常用的qPCR办法有荧光染料法（SYBR Green I）和探针法（TaqMan）。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反响系统中，参加过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，来确保荧光信号的添加与PCR产品的添加彻底同步。探针法（常用TaqMan探针）：探针完好时，陈述基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使陈述荧光基团和淬灭荧光基团别离，然后荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子构成，完结了荧光信号的累积与PCR产品的构成彻底同步。

　　巢式PCR（Nested PCR）是指运用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，第二轮的扩增产品才是意图基因片段。假如榜首对引物（外引物）的错配导致非特异性产品被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物辨认并持续扩增的可能性十分小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提高。进行两轮PCR的一个长处是：有助于从有限的开端DNA中扩增得到足量的产品。巢式PCR的试验原理为依据DNA模板序列规划两对引物，运用榜首对引物（称为外引物）对靶DNA进行15-30个循环的规范扩增；榜首轮扩增完毕后将一小部分开端扩增产品稀释100-1000倍参加到第二轮扩增系统中作为模板，运用第二对引物（称为内引物或巢式引物，结合在榜首轮PCR产品的内部，进行15-30个循环的扩增，第二轮PCR的扩增片段短于榜首轮。

　　下降PCR（Touchdown PCR）是一种通过调整PCR循环参数，提高PCR反响特异性的办法。在下降PCR中，前几个循环的退火温度设定为，比引物的最高退火温度（Tm）再高几度。较高的退火温度能有实际效果的削减非特异性扩增，但一起较高的退火温度会加重引物与方针序列的别离，导致PCR的产值下降。因而在开端的几个循环中，退火温度一般设置为每个循环下降1℃，以添加系统中意图基因的含量。当退火温度下降到最佳温度时，剩下循环都保持此退火温度。通过这种办法，在PCR进程中，所希望的PCR产品得到有选择性的添加，而几乎不行能会呈现非特异性的产品。

　　注：通过以较高的温度开端，再跟着循环逐步下降到最佳退火温度（黑色曲线），这种PCR办法可提高反响特异性（黄色曲线）。方针扩增子的产值（绿色曲线）相应的得到富集。

　　直接PCR是指直接从样品扩增方针DNA，无需进行核酸别离纯化。直接PCR分两类，直接法：取少数样本直接参加到PCR Master Mix中，进行PCR判定；裂解法：样本取样后，参加裂解液中，裂解开释基因组，取少数裂解上清液参加到PCR Master Mix中，进行PCR判定。这种办法简化了试验流程，削减了着手操作时刻，一起可防止纯化进程DNA的丢失。

　　引荐具有高组成才能的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA开释到裂解液中，它们会按捺PCR反响。具有高组成才能的DNA聚合酶能够耐受这些按捺剂，然后使直接PCR成为可能。具有高组成才能的聚合酶一般具有更高灵敏度，因而可从未纯化样本中扩增微量的DNA。

　　堆叠延伸PCR技能 (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是选用具有互补结尾的引物，使 PCR 产品构成了堆叠链，然后在随后的扩增反响中通过堆叠链的延伸，将不同来历的扩增片段堆叠拼接起来的技能。这项技能现在首要有两个运用方向：构建交融基因；基因定点骤变。

　　反向PCR （Inverse PCR, IPCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两边的末知序列进行扩增。反向PCR规划之初是为了用于确认附近不知道区域的序列，多用于研讨基因的发动子序列；致癌性染色体重排，如基因交融、易位和转座；以及病毒基因整合，现在也常用于定点骤变，仿制一个具有预期骤变的质粒。反向PCR流程，首要对模板进行限制性酶切消化和衔接，选定的限制性内切酶不行剪切已知序列，然后使衔接发生于侧翼不知道序列之间。运用低浓度的酶切DNA片段优化衔接进程，使其倾向于自我衔接而非多片段衔接（即构成连环体）。完结自我衔接后，从DNA的已知区域发动反向PCR。所取得的扩增子每个结尾都含有部分已知DNA序列。随后，对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。

　　数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种核酸分子肯定定量技能。当时核酸分子的定量有三种办法，光度法依据核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（Real Time PCR）依据Ct值，Ct值就是指能够检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技能，依据单分子PCR办法来进行计数的核酸定量，是一种肯定定量的办法。首要是选用当时分析化学抢手研讨范畴的微流控或微滴化办法，将很多稀释后的核酸溶液涣散至芯片的微反响器或微滴中，每个反响器的核酸模板数少于或许等于1个。这样通过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反响器就会给出荧光信号，没有模板的反响器就没有荧光信号。依据相对份额和反响器的体积，就能够推算出原始溶液的核酸浓度。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于比如低频等位基因的区分、病毒滴定和二代测序文库的肯定定量。