【云飞杂记】细菌传之伯乐

  胃里有时冷，有时热，有时酸雾弥漫，有时泥沙聚下，说不定还会爆发生化战争，幽门螺旋杆菌仍然能够顽强的长期生存。当细菌猎人追踪幽门螺旋杆菌的时候，另一些事情正在持续发酵。1983年，美国化学家穆里斯实现了聚合酶链式反应（PCR），扩增了大肠杆菌人工合成质粒（pBR322）中一个小片段。很多重大科学技术突破始于无比单纯的好奇、无关痛痒的发现和无中生有的脑洞，这项跨时代的分子生物学技术也不例外。

  云飞：嗯，大肠杆菌工程菌不带质粒，可是自然界的大肠杆菌一般都有质粒。质粒编码细菌的某些性状，如性菌毛、毒素和耐药性等，虽非生命必须，但有逆天神通。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。pBR322是研究最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒。“p”代表质粒；“BR”是合成它的两位科学家姓氏的字首，“322”是实验编号。扯远了，马上拉回来！

  故事要从美国黄石国家公园说起。在水温70℃的“蘑菇泉”中，生活着一种粉橙色的水生嗜热细菌。该发现轰动一时，因为它刷新了对细菌生存温度上限的认知。

  云飞：当时一致认为“细菌能承受的最高温度是55℃左右”。生物都有适宜生存的温度范围，一般取决于生物体内的酶，因为超过一定的温度，酶就会失活，这在某种程度上预示着水生嗜热菌的酶能耐受更高的温度。

  1973年，中国台湾女生钱嘉韵赴美留学。在辛辛那提大学生物系读研期间，她的导师对嗜热菌非常感兴趣，于是让钱嘉韵以此为课题。钱嘉韵从嗜热菌中提取了脱氧核糖核酸聚合酶，在95℃时仍然不失活性，命名为“TaqDNA聚合酶”。然而，在短暂的兴奋之后，好像没什么实际用途。现在看，也许只能用好奇心驱使下的“抢跑”来解释。1975年获硕士学位后，钱嘉韵去了衣阿华州立大学，并在那里取得神经生物学博士学位。那篇历史性论文，发表于1976年的《细菌学》杂志，她是第一作者，只不过用了英文名字Alice，再加上她后来挂了夫姓，以至没有太多人知道，该篇被广为引用的文章的作者A.Chien就是钱嘉韵。

  一晃十年，1983年春，穆里斯和女友共度周末。夜色迷人，佳人相伴。穆里斯自驾在蜿蜒盘旋的128号公路上，一个念头迷幻般涌现：扩增脱氧核糖核酸片段时，只要添加的引物足够，是不是能够无限循环地扩增下去？

  云飞：128号公路是毗邻美国马萨诸塞州波士顿市的一条92公里长的半环形公路，距波士顿市区约16km，沿着公路两侧线状分布数以千计的技术型企业和研究机构，这中间还包括麻省理工学院和哈佛大学在内的65所高等院校。二战期间，美国对军用品的需求给这个地区带来大笔订单。二战结束时，128号公路则成为“科研一条街”，成就了宝丽来、雷神等一批有名的公司。到了冷战时代，128号公路参与到太空竞赛当中，以计算机和雷达技术为基础，开发半自动地面环境防空系统。但随着冷战的结束和太空竞赛的趋缓，国防订单大幅度减少，大量公司倒闭，128号公路出现了一时的萧条。与此同时，计算机技术“民”成功，128号公路开始形成面向企业客户的小型计算机产业中心。到了上世纪70年代末，几百家各种文字处理与电脑公司在此汇集，包括数字设备公司、王安电脑、霍尼韦尔、克莱威特等大企业，形成了一种以纵向一体化为主、企业间相互独立的产业集群格局。计算机销量占据全美市场占有率的40%以上。但从上世纪80年代开始，纵向一体化的模式令128号公路错失个人计算机和互联网的发展浪潮，受到来自硅谷的巨大冲击，王安电脑、阿波罗电脑等一批在当时引领文字处理和图形处理的明星企业暗淡退场，硅谷开始取代128号公路成为新的计算机工业中心。来到新千年、新世纪，128号公路凭借着在生命科学与物理学、化学、工程学、计算机科学等多学科领域的技术融合，再次崛起，使128号号公路成为全美著名的生物技术走廊，也使阿斯利康、赛默飞、诺华、辉瑞等全球知名生物医药企业汇聚波士顿，造就了这座“基因城”。在“全球最具创新性一平方英里”、“全球医药产业的华尔街”——肯德尔广场，全球TOP20生物医药公司中的18家在此设立办公机构，生物技术公司超过250家，其中80%为初创企业。128号公路的发展几经沉浮，始终能爆发出旺盛的创新生命力，在于其创新链条重要的三环：知识源头、金融保障、政府扶持。

  健客：对了，之前讲过脱氧核糖核酸聚合酶，是脱氧核糖核酸复制时起催化作用的酶，在细胞中都会存在，但什么是引物呢？

  云飞：这要从华裔分子生物学家吴瑞说起。他建立了第一个脱氧核糖核酸测定方法，是脱氧核糖核酸测序之父。他的策略是利用能定位的引物加以延伸，合成新的有标记的脱氧核糖核酸。桑格的脱氧核糖核酸测序法和穆里斯的聚合酶链式反应都建立在吴瑞提出的引物延伸原理的基础上。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一段引物与靶区域一端的一条脱氧核糖核酸模板链互补，另一段引物与靶区域另一端的另一条脱氧核糖核酸模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合的起始点。

  云飞：嗯，术语比较无趣，咱们跳过去不说。逻辑更重要，反而不太难。之前讲过，脱氧核糖核酸由两条脱氧核苷酸链构成。如果把脱氧核糖核酸比作一条拉链，那么引物就是人工添加进去的拉链头。一条拉链解开后变成两条单链，其中一个拉链头对着一条单链的前端，另一个拉链头对着另一条单链的后端。

  健客：为什么非要一前一后呢？不能都对着前端或者都对着后端吗？真实的生活中的拉链头都在前端啊！

  云飞：哈哈，如果都对着一端，那么添加的引物不就自己和自己接上了。扯远了，马上拉回来。

  穆里斯靠边停车，掏出纸笔开始演算。这种扩增方法，每次循环得到的脱氧核糖核酸片段都是上一循环的二倍，那么循环10次，就能扩增1024倍；循环36次，就超过687亿倍！这一个数字太惊人，这个思路太简洁，穆里斯一时之间都无法相信，之前居然没人尝试过。他反复查阅资料之后，在西特斯公司内部的科研会议上分享了自己的想法。然而，同事们完全不觉得这有什么厉害之处。穆里斯花了几个月时间寻求认同，但赞同者寥寥无几，这期间，他与女友的感情也出现了裂缝，直到9月，他才开始第一次实验。那个夜晚，他把聚合酶加入试管后就回家了，满心以为脱氧核糖核酸已经在管中自己成倍扩增。然而第二天中午，他没能看到期望的结果。

  云飞：出在酶的活性上。在体外，脱氧核糖核酸高温变性，互补链分开成两条单链，就像解开的拉链；低温退火，引物与单链按碱基互补配对的原则结合，就像对上新的拉链头；再调温至脱氧核糖核酸聚合酶最适反应温度，单链合成新的互补链，就像拉上新的拉链。开始时，穆里斯用大肠杆菌的脱氧核糖核酸聚合酶，虽然这种酶是人类的老朋友，但是不能耐受高温。脱氧核糖核酸变性温度为95℃左右，随着温度上升，这种酶会失去活性，因此，加入的酶只能用一轮，而后面的每一轮都需要手动加入。

  穆里斯不喜欢重复劳动，如果一件事需要反复做同一个流程，那么他会倾向于写个程序来解决。但他不得不承认，反复地加热、冷却、添加聚合酶，这枯燥的工作是绕不过去的坎儿。接下来的三个月里，穆里斯为了感情问题焦头烂额，他磨磨蹭蹭地进行着实验。在1983年圣诞节，他终于成功扩增了pBR322质粒的一个小片段。

  1984年，穆里斯再次向同事介绍了自己的成果，依旧说了个寂寞。之后又发生了好多事，谢天谢地谢伯乐，在西特斯技术副总裁的支持下，不走运的穆里斯坚持走在研究聚合酶链式反应的道路上。这种扩增技术需要做到规模化、自动化、快捷化，才能体现价值。关键在聚合酶的选用，直到穆里斯团队找到了钱嘉韵的那篇论文，TaqDNA聚合酶应用其中，大放异彩。聚合酶链式反应的最大特点，是能将微量的脱氧核糖核酸大幅扩增。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的脱氧核糖核酸，就能用聚合酶链式反应加以放大，进行比对，彰显“微量证据”的威力。

  1985年冬，一篇正式介绍聚合酶链式反应原理的论文送到《自然》杂志，拒稿；再投《科学》杂志，再拒。他们都以为只是技术革新类的东西。在吴瑞的推荐下，1987年，穆里斯的论文发表在《酶学方法》杂志上。

  云飞：好，这是我的荣幸。1928年8月14日，吴瑞在北京出生，1948年来到美国，1950年在阿拉巴马大学获得化学学士学位，1955年在宾夕法尼亚大学获得生物化学博士学位，1961年加入美国国籍，1966年成为康奈尔大学生物化学和分子生物学副教授，1972年晋升为教授。吴瑞创建了中美生物化学联合招生项目（CUSBEA），1982年至1989年间，该项目共招收了400余位顶尖的中国学生来美学习研究生课程，其中100多人在知名大学任教或在产业界担任重要职位。1998年，“吴瑞协会”在美国加州大学洛杉矶分校成立，2004年更名为“华人生物学家协会”，成为代表北美及其它地区3000多名华人生物学精英的专业组织，致力于推动生命科学前沿研究。2001年，吴瑞当选中国工程院外籍院士。

  2008年2月10日，吴瑞因心脏病去世，享年79岁。吴瑞去世后，很多人写了纪念文章。饶毅这样介绍吴瑞的学术成就：脱氧核糖核酸测序方法，桑格的贡献最大——他发明了测序方法的几个关键步骤，获诺贝尔奖当之无愧。桑格曾撰文表示，吴瑞1968年第一个测定脱氧核糖核酸顺序。不过当年的方法不能普遍应用、也不能测长序列脱氧核糖核酸。1971年吴瑞的引物延伸，是测序的一个关键步骤，给奖是可以的。桑格在1980年诺贝尔奖获奖演说中没有提及吴瑞的工作，但是他在1988年的《生物化学年评》长篇自传、在2001年的《自然-医学》短文中，都肯定了吴瑞的工作。得奖可以留在人们的口中，对于留传于世的发明和发现，即使很多人不明确知道发明者，发明仍活在人们的脑中。吴瑞的美国同事、长期合作者、高级研究助理加格说：“他不知疲倦地帮助别人，他的慷慨和精神将伴随我们到永远。我和他都有一个梦想，就是看见我们的研究成果使全世界的人民受益，我们为了这个梦想而奋斗。我感激他为我提供了一个在康奈尔大学工作和参与转基因水稻研究的绝好机会。”

  聚合酶链式反应已经走过最艰难的时刻。然而共苦的伙伴，却很难同甘。一方面，是聚合酶链式反应发明人之争；另一方面，是西特斯不太公平，穆里斯获得了一万美元的奖金，团队其他成员只象征性地收到了一美元，这让分歧更大了。有人把穆里斯推荐给沃森，沃森一见穆里斯，顿感惊才绝艳。1986年夏，沃森邀请穆里斯参加“人类分子生物学”会议，报告聚合酶链式反应的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，而且参会的都是学术界的大牛。穆里斯一鸣惊人，但与西特斯的关系更加恶化。1986年秋，穆里斯离开了西特斯。西特斯给了他5个月的薪水，但按产业惯例，聚合酶链式反应的专利权属于西特斯。“人类分子生物学”会议专刊于1986年冬出版，公布了一系列最新研究成果，让基因组测序突然变得触手可及。其中最关键的技术突破或许要归功于穆里斯。为了可以进行基因测序，首先要具备充足的脱氧核糖核酸。单个细菌细胞能够最终靠“发酵”，达到百亿级别的数量，为测序提供了丰富的细菌脱氧核糖核酸。但是想要获得同样数量级的人类细胞谈何容易。不过穆里斯已经发现了一条捷径。1992年，聚合酶链式反应的专利卖了3亿美元。1993年，穆里斯登上诺贝尔领奖台，大谈童年时光与128号公路上的那个夜晚。获奖后，他实现了一直以来的出书梦，《心灵裸舞》于1998年出版，以亲身经历介绍聚合酶链式反应的传奇故事。同年，《》评价：生物学自此分为聚合酶链式反应之前，聚合酶链式反应之后。

  2019年8月7日，聚合酶链式反应之父穆里斯因肺炎去世，享年74岁。后来白肺肆虐人间。两者之间有无联系？我不知道，但聚合酶链式反应可以探明真相。事实上，在新冠病毒肺炎疫情防控中，聚合酶链式反应以快制快，大放异彩。这个放在《病毒传》中慢慢聊。

  2022年10月3日，瑞典卡罗琳医学院揭晓诺贝尔生理学或医学奖。该奖项授予瑞典遗传学家帕博，以表彰他对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现做出的贡献。帕博对于聚合酶链式反应在古人类的应用有贡献。那时聚合酶链式反应已经是热门，到处被应用。但是，古人类脱氧核糖核酸分析的最大困难是如何排除污染物。聚合酶链式反应越敏感，污染的问题就越大。帕博发现其他人号称分析的恐龙脱氧核糖核酸不是恐龙的、而是污染物的脱氧核糖核酸。帕博建立清洁的实验室，避免或减少污染。技术过硬、经费充足、检测不懈，帕博不仅是这一领域最高产的，而且有重要发现，如分析尼安德特人的基因组等，从而有原创发现。

  如果穆里斯和帕博是千里马，那么吴瑞既是千里马，更是伯乐。这倒不是非说吴瑞是穆里斯的伯乐，在西特斯，穆里斯有支持者；吴瑞和沃森也帮助过他。或许能这样歪解伯乐：以助“千里马”为乐的长者。策之以其道，食之尽其材，鸣之通其意，这些是伯乐的能力，助之为乐是伯乐的胸襟，而使命感才是伯乐的精神力量。北京大学生命科学学院教授顾孝诚在《我所认识的吴瑞》一文中说：“吴瑞做了许多不平凡的事儿，却给你感觉是个平凡的人。他用平凡的心态对待一切事情。有些老辈的华人，甚至更年轻的华人，在美国成功以后，对中国人的态度就和他不同，我是见过的。可是吴瑞对中国人之友好到了一种非常细致的程度，你可能承受了都不知道。” CUSBEA项目学生、美国印第安纳大学医学院教授严聪在《悼吴瑞先生》的文章中写道：“他是我一生的贵人，中国生物界的贵人，乃至中美交流的贵人。他用一己之力开了历史的先河；他用一颗中国心架起了中美科技交流的桥梁；他用一双手播下了未来参天大树的种子；他用一个伯乐的睿智为世界生物界相中了几百匹千里骏马；他用一生的人格为我们树立了光辉榜样。”在这篇文章中，严聪回忆了与吴瑞唯一的一次会面，他说：“我和先生只有一面之缘，那是在纽约，第一次CUSBEA年会上。他是一个非常谦虚的学者，要和他讲话的人很多，我只能和他握握手，当他去世后，这仅有的一次握手显得弥足珍贵，仿佛他把接力棒交给了我。”在一次采访中，记者问：您作为德高望重的科学家，如今成为伯乐、做人梯，您对年轻人有什么希望？吴瑞答：现在学生素质都很高，尤其拿到博士学位的大多数都很聪明，而且，在我这一学科领域又要求动手能力很强，这两方面合在一起，再加上个人的努力，才能做出真正的突出贡献。一般来说，至少在国外的中国学人，他们学习、工作很努力，很勤奋，比别国的人，比美国人同样地位的，上班时间都长，而且很专心于学术。在国内，似乎杂事比较多，不能把全部的精力放在科研方面。这是不好的。另外，在国内已经有五到十年工作经验的教授或研究员，如果每年出去开一次或两次会，每次一两个礼拜，同国际前沿保持联系，有新的发现就可以互相交流，这是很重要的。如果有条件还可以去一两个月，两三个月，不断学习一些新的东西也很好，但目前这样的一种情况还不多。尤其是生命科学领域发展非常快，新的技术或想法不断涌现。如果没有接触就会落后。因此，我主张留学回国后，也要通过种种方式，各种渠道保持与国外的联系。当然，国内的科研条件和环境，比10年前已经好了许多。但与国外相比还有一定差距，比如，搞生命科学研究，常需要从国外进口一些重要的试剂或别的材料，有时就会很麻烦，不能及时地、顺利地到达科研人员手上，结果让那些科研人员，几次三番跑海关，跑机场……使科研人员花费很大工夫去做这种不应该花时间的事情。第二个问题是，有的研究人员，一旦工作做好了，就会有许多非科研业务以外的行政责任或别的任务加到他的身上，当然，有些工作也很重要，但是我认为不要过多了。一个人的时间、精力毕竟有限。让他去做其他事情，也可以有些贡献，但是对他科研进程会有负面影响。我认为，要尽力保护科研人员，保护学者，让他们集中精力在科研上有更大的发挥和突破。这番线年说的，现在听来仍然觉得言之谆谆，意之殷殷。

  让我们回到1986年夏，“人类分子生物学”会议推动了人类基因组计划，这个计划与细菌有啥关系呢？

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